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摘要

糖尿病发展为痴呆的风险增加，迫切需要有效治疗糖尿病诱发的痴呆。yokukan (YKS)是一种传统的日本药，由7种干燥的草药组成。YKS在临床上用于治疗包括痴呆在内的几种神经系统疾病。本研究旨在揭示横参散对糖尿病性痴呆小鼠学习记忆功能的影响，并阐明诱导横参散和未治疗糖尿病模型小鼠海马区作用的分子机制。Morris水迷宫试验显示横参汤能显著改善糖尿病模型小鼠的学习记忆功能。在蛋白质组学分析中，横参多糖治疗的糖尿病模型小鼠海马中有10个(4个上调，6个下调)蛋白和8个(3个上调，5个下调)蛋白的表达发生了显著变化。这些蛋白和磷蛋白在功能上可分为神经元发育蛋白、细胞骨架蛋白、能量代谢蛋白、氧化还原酶蛋白、蛋白去泛素化蛋白、质子转运蛋白和伴侣蛋白。其中，神经元发育蛋白、细胞骨架蛋白、氧化还原酶蛋白和蛋白去泛素化蛋白被报道与AD患者的学习和记忆功能障碍有关。此外，western blotting验证了CAPZB、tubulin beta-5链和LDHB的变化。综上所述，这些结果表明横须参能改善糖尿病性痴呆小鼠的学习和记忆功能，这是海马区蛋白质和磷蛋白表达改变的基础。 We propose that yokukansan could be effective for care of diabetes-induced dementia.

关键词

痴呆症，糖尿病，海马，蛋白质组，横须赛

介绍

糖尿病是一种以高血糖和胰岛素抵抗为特征的糖稳态受损疾病[1]。作为一种影响中枢神经系统的疾病，慢性高血糖会导致认知障碍。糖尿病引起的痴呆在临床和病理生理上不同于阿尔茨海默病（AD）。糖尿病所致痴呆的临床特征是注意力受损较多，但单词记忆受损较少，认知障碍进展缓慢[2]。淀粉样β和磷酸化tau在糖尿病性痴呆患者的脑脊液中显示正常水平[3]。有趣的是，流行病学证据表明糖尿病增加了患痴呆症（如AD）的风险[4]。糖尿病可能增加AD风险的一些生物学机制已被假定为：血管机制、高血糖的毒性作用、大脑胰岛素抵抗、晚期糖基化终产物的形成以及胰岛素降解酶的竞争导致淀粉样β降解减少[5]。因此，我们对这些差异产生了兴趣，并对AD和糖尿病模型小鼠的海马和皮质进行了蛋白质组学分析，以阐明AD与糖尿病诱发痴呆的分子机制差异[6-8]。此外，与这些改变的蛋白质的正常化相关的糖尿病性痴呆的改善令人感兴趣。

横须赛（YKS），传统日本人kampo.中药，由七种干药材组成：苍术根茎Atractylode Lankea.菌核)、茯苓菌核茯苓狼)，蛇床子(蛇床子)CNIDIUM Officinale.牧野)，钩钩(钩的钩藤Miquel），日本当归根（根）当归acutiloba北川根（Bupleurum Root）（根）Bulpleurum falcatum甘草（植物的根和匍匐茎）glycyrrhiza uralensis费舍尔）。YKS目前临床使用，以治疗与痴呆症（BPSD）相关的行为心理症状，这些症状经常在诸如AD [9]的神经系统疾病中观察。YKS减少了5-HT的表达_2A在5-HT治疗的小鼠中，bsd得到改善_{2A / 2C.}受体激动剂2,5-二甲氧基-4-碘安非他明[10]。最近，有报道称YKS可改善AD模型大鼠的认知功能[11]和Tg2576小鼠的空间认知缺陷[12]。YKS可增加重复脑缺血大鼠的自发乙酰胆碱释放并抑制海马细胞凋亡。YKS对β-淀粉样蛋白诱导的大鼠[14]皮质神经元细胞毒性具有神经保护作用。因此，有必要研究YKS对痴呆是否有效，并进一步阐明YKS对糖尿病性痴呆的作用。

在这项研究中，我们通过Morris水迷宫（MWM）检查了YKS对显示痴呆症的糖尿病模型小鼠的影响，然后使用二维凝胶电泳处理的糖尿病模型小鼠中海马蛋白和磷蛋白的表达变化（2-de）随后用Sypro Ruby和Pro-Q金刚石染色和随后的质谱，以阐明YKS对糖尿病诱导的痴呆症的影响下面的分子机制。我们的结果表明，所鉴定的蛋白质和磷酸磷蛋白参与在糖尿病模型中的YKS提高学习记忆功能。

材料和方法

材料

链脲佐菌素(STZ)、尿素、硫脲、SDS、3-[(3- cholamidopropyl) dimethylammonio]丙磺酸盐(CHAPS)、2-巯基乙醇、二硫苏糖醇(DTT)、溴酚蓝、碘乙酰胺、RNase A和DNase I购自日本大阪Wako Pure Chemical Industries Ltd.。YKS的干粉状提取物由日本东京TSUMURA公司提供。所有其他分析试剂和材料的来源信息在下面的材料和方法小节中分别说明。

动物

本研究中使用了七个月的雄性C57BL / 6只小鼠。C57BL / 6鼠（日本SLC，Inc. Shizuoka，Japan）被安置12小时光/暗循环和自由获得食物和水。动物监测频率为每周一次。每次，评估动物的健康、身体状况和福祉。

用STZ治疗的糖尿病模型小鼠的产生

STZ对胰岛中分泌胰岛素的β细胞有毒性，STZ可诱导持续的高血糖状态[15]。采用STZ (50 mg/kg溶解在100 mM柠檬酸缓冲液中，pH 4.5)腹腔注射，每天1次，连续5天，建立认知障碍的糖尿病模型小鼠[6,16]。注射1周后，将小鼠分为2组:对照组，饲喂标准饲料颗粒(CLEA啮齿类动物饲料CE-2, CLEA Japan, Inc.， Tokyo, Japan)，隔离9周;治疗组，饲喂含1% YKS的标准饲料颗粒(w/w)，隔离9周。随后，使用血糖仪(Terumo Co. Tokyo, Japan)测量尾静脉血液中的血糖水平。选择血糖水平高于400 mg/dL的小鼠进行后续研究[6,17]。

行为测试

使用Morris水迷宫（MWM）测试的两组小鼠研究了学习和记忆功能[18]。迷宫包括圆形黑色池，直径为96厘米。迷宫充满了温度约23℃的水。池圆周的四个相同的间隔位置将池分为四个象限，用作起点。10厘米直径的逃生平台位于水面下方的2厘米处，在其中一个象限的中心的固定位置。所有雄性小鼠连续5天每天举行5次培训试验。每个鼠标允许长达60秒才能找到潜在平台。记录了检测平台的时间（逃生延迟）。获取后一天，进行探测试验以通过去除平台来评估内存水平。通过开场测试检查小鼠的运动活性[19]。

蛋白质的提取

如前所述进行蛋白质提取[6]。YKS-和未治疗的糖尿病模型小鼠在用戊巴比妥钠钠下被麻醉。将海马从每组中的三只小鼠中分离出来并分别混合两组。通过裂解缓冲液的声音裂解小鼠海马样品，由7米尿素，2m硫脲，5％乳液，2％固定的pH梯度（IPG）缓冲液（GE Healthcare UK Ltd.，Buckinghamshire，英国），50 mm 2-巯基乙醇，2.5μg/ ml DNase I和2.5μg/ ml RNase A.通过以15,000×g离心30分钟，4℃除去任何不溶性物质。

二、凝胶染色和图像分析

双德是等电聚焦和SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的组合，这允许通过分子电荷和分子量分离蛋白质。如前所述[6]进行2 de。将样品（1000μg蛋白质）施加到IPG凝胶条（pH 4-7; 7厘米; GE Healthcare）。聚焦在50 V开始6小时，在100 v持续6小时，最后在2000 v持续6小时。聚焦后，首先在50mM Tris-HCl，pH 8.8,6M尿素，1％SDS，30％（v / v）甘油中，第一次平衡IPG条带15分钟，溶液，30％（v / v）甘油，1％（w / v）dtt其次与2.5％（w / v）碘乙酰胺更换dtt的相同缓冲液。将平衡的IPG条带在5mA /凝胶中转移到15％SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）凝胶上7小时。

用50%甲醇和10%醋酸固定后，凝胶进行双染色，首先用Pro-Q Diamond (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA)，然后用SYPRO-Ruby (Life Technologies)，按照[6]中描述的步骤进行。使用Fluorophorestar 3000图像捕捉系统(Anatech，东京，日本)拍摄图像。

使用Prodigy SameSpots软件（非线性动态，英国泰恩斯州纽卡斯尔）进行凝胶点的图像分析和量化。通过通过所有匹配斑点的总强度归一化并比较来自YKS处理和使用ANOVA的对照小鼠的样品之间的点强度差异来鉴定差异表达的斑点。

MALDI-TOF-MS的蛋白质鉴定。

切除感兴趣的斑点，用测序级改良胰蛋白酶(Promega, Madison, WI, USA)进行凝胶消化，如[6]所示。通过MALDI TOF MS/MS (ABI PLUS 4800, Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)鉴定消化的肽片段，并使用Mascot搜索引擎(Matrix Science, Boston, MA, USA)通过NCBInr数据库进行Mascot MS/MS离子搜索。

Western Blotting.

将分离的海马样品在含有20mM Tris-HCl，pH 7.0,6M尿素，150mM NaCl，2mM EDTA和1％Triton X-100的缓冲液中均化。将匀浆酸盐进行8％SDS-PAGE，将凝胶转移到Imobilon-P聚偏二丙烯二氟化乙烯膜上（Millipore，Bedford，MA）。在脱脂乳封闭5％后，将膜与兔抗CapzB孵育（稀释1：1,000，Abcam，Abcam，Ma，USA），小鼠抗微管蛋白β-5链（稀释1：1,000，Abcam），兔子抗LDHB（稀释1：1,000，ABCAM）和兔抗GAPDH（稀释1：10,000，eBENTIER，韩国）抗体，在4℃下过夜。将膜与二抗（稀释1：5000，GE Healthcare UK Ltd.）孵育与辣根过氧化物酶（HRP）在室温下缀合1小时。参考GAPDH的值校正所有值，用作内部标准。使用ECL Prime Western印迹检测试剂（GE Healthcare UK Ltd.）检测目标蛋白。扫描蛋白质条带，并用多功能仪2.2软件（富士Photofilm，日本）分析了它们的光学密度。

统计分析

各密度定量显示为平均值±S.E.M。所有数据均通过Student t检验和重复测量方差分析（ANOVA）进行测试，然后进行Bonferroni检验，以评估各组之间的差异。P<0.05被认为是统计学意义。

结果

YKS可改善糖尿病模型小鼠学习记忆障碍

进行MWM测试以评估用YKS处理的糖尿病模型小鼠的学习和记忆功能。在MWM测试之前，通过开场测试测量的小鼠的自发运动活性在所有组中没有不同（数据未显示）。与未处理的糖尿病模型小鼠（CTL小鼠）相比，YKS处理的糖尿病模型小鼠（YKS小鼠）显示出逃逸潜伏期下降的趋势，表明YKS诱导改善学习和记忆功能的提高（图1A）。在目标象限中所花费的时间显着增加（P< 0.05)，与CTL小鼠相比(图1B)。这些结果表明，YKS可改善受损的学习和记忆功能。

图1。YKS治疗糖尿病模型小鼠(YKS小鼠)和糖尿病模型小鼠(CTL小鼠)学习记忆的研究。(A)从第1天到第5天，逃离潜伏，找到隐藏平台。(B)显示60秒内在目标象限所花费的时间。结果为平均值±S.E.M. (n = 5)p< 0.05 vs CTL小鼠

yks治疗糖尿病模型小鼠海马区改变蛋白和磷蛋白的鉴定

采用Prodigy samspot软件和MALDI-TOF MS/MS对YKS小鼠和CTL小鼠海马区蛋白和磷蛋白的表达变化进行定量和鉴定。图像分析显示SYPRO红宝石染色2-DE凝胶(图2A)和Pro-Q钻石染色2-DE凝胶(图2B)上分别有大约400个蛋白点和200个磷蛋白点。我们在海马中检测到10个(4个上调，6个下调)蛋白和8个(3个上调，5个下调)磷蛋白(表1)。这些蛋白和磷蛋白使用PANTHER数据库进行功能分组，如表1所示。表达量增加的4个蛋白经鉴定为二氢嘧啶酶相关蛋白2;f -肌动蛋白capping蛋白亚基亚型c;alpha-tubulin部分;和烯醇化酶1B，逆转录，和6个表达水平下降的蛋白被鉴定为胶质细胞成熟因子，β，亚型CRA_a，部分;把。beta-actin (aa 27 - 375);微管蛋白beta-5链; ATP synthase, H⁺运输，线粒体F0复合物，d亚基;l -乳酸脱氢酶B链亚型1;泛素羧基端水解酶L1亚型CRA_a(表1)。3个表达水平升高的磷酸化蛋白被鉴定为-烯醇酶亚型1;微管蛋白alpha-1C链;和液泡腺苷三磷酸酶亚基A, 5个表达量下降的磷酸化蛋白被鉴定为吡哆醛激酶;gamma-enolase同种型1;dihydropyrimidinase-related蛋白2;角蛋白，II型细胞骨架6A;和热休克蛋白70同源蛋白(表1)。

图2。YKS治疗的糖尿病模型小鼠（YKS小鼠）和糖尿病模型小鼠（CTL小鼠）海马蛋白（A）和磷酸蛋白（B）的代表性2-DE凝胶。将约1000μg海马蛋白装载在IPG条带（pH 4-7）上，并通过双向电泳分离（15%）。等电点（PI）和实验质量显示在X轴和Y轴上。表达水平改变的蛋白质通过与表1中的点号相对应的数字进行识别。实验分别进行了三次。显示了代表性的凝胶图像

表格1。在海马体中识别的蛋白质和磷蛋白及其功能分类

2-DE分离小鼠海马蛋白和磷酸蛋白，胰酶凝胶消化，MALDI-TOF MS/MS鉴定。图2所示的斑点代表了已鉴定的蛋白质，并由它们的基因ID登录号(GI acc)指定。no)，用于NCBI非冗余(NCBI nr)蛋白数据库。给出了与概率分配、分子量、pI和序列覆盖率(SC)相关的分数。通过吉祥物数据库检索(http://www.matrixscience.com.）。将斑点密度与糖尿病模型小鼠（CTL小鼠）值进行比较。P价值由ANOVA获得，P< 0.05。

YKS处理糖尿病患者小鼠海马蛋白质的蛋白质印迹分析

进行Western印迹分析以验证F-actin-覆盖蛋白亚基β同种型C，管蛋白β-5链和L-乳酸脱氢酶B链同种型1的同一性，如差异表达的海马蛋白。F-肌动蛋白封端蛋白亚单位β同种型C的蛋白质水平倾向于增加（P= 0.54)(图3A)。微管蛋白-5链和l -乳酸脱氢酶B链isoform 1蛋白水平呈下降趋势(P= 0.68和0.47)(图3B和C)。

图3。用于评价F-actin-封装蛋白亚基β同种型C（CapZB）（A），管蛋白β-5链（B）和L-乳酸脱氢酶B链同种型1（LDHB）的表达的蛋白质印迹的代表性图像进行了评价的蛋白质印迹（c）来自YKS治疗的糖尿病模型小鼠（YKS小鼠）和糖尿病模型小鼠（CTL小鼠）的海马。蛋白质表达水平被归一化至甘氨醛3-磷酸脱氢酶（GAPDH）表达，并表示为相对于CTL小鼠中的比例。数据显示为平均值±S.E.M.四个或五个独立实验。代表频带显示在每个图表上方

讨论

我们首先通过MWM实验证明YKS能够改善stz诱导的痴呆糖尿病模型小鼠的学习记忆功能，然后确定10蛋白质和8磷蛋白质的表达相关的分子机制这些有利影响yk使用2 de加上女士这些蛋白质和磷蛋白质可能有助于改善学习和记忆功能受损diabetes-induced痴呆。

MWM测试

有报道称YKS可改善AD鼠模型的认知功能障碍[11,12]。同样，我们在MWM实验中发现，YKS可以改善糖尿病模型小鼠受损的学习和记忆功能。结合其他研究结果，提示YKS对阿尔茨海默病和糖尿病性痴呆都有好处。

神经元发展

二氢嘧啶酶相关蛋白2 (dihydropyrimidase -related protein 2, DPYSL2)，也被称为崩溃蛋白反应中介蛋白2，与微管结合并调节其组装，导致轴突生长和神经元极性[20]。过表达DPYSL2可增加体外培养的海马神经元[21]的轴突延伸。脑特异性DPYSL2敲除小鼠在MWM[22]中表现出空间学习和记忆缺陷。AβPPswe/PS1dE9小鼠[23]海马区DPYSL2蛋白表达水平降低。重要的是，我们还证明了在突触可塑性[24]期间，海马中DPYSL2的表达增加。因此，YKS治疗后DPYSL2表达增加，可能影响海马突触可塑性，从而改善糖尿病性痴呆。

DPYSL2磷酸化负调控微管生长和稳定性[25]。在AD患者和一些小鼠模型[26]中，DPYSL2在Ser522位点被Cdk5磷酸化，随后在Ser518、Thr514和Thr509位点被GSK-3β磷酸化。在AD脑[27]中，磷酸化的DPYSL2与神经原纤维缠结和异常的神经突相关。在我们之前的研究中，stz诱导的糖尿病模型小鼠[6]海马区磷酸化DPYSL2表达增加。我们发现YKS小鼠海马中磷酸化的DPYSL2表达降低。因此，YKS治疗后海马磷酸化DPYSL2表达的降低可能有助于改善糖尿病性痴呆突触可塑性受损。

细胞的细胞骨架

在活细胞中，肌动蛋白以单体(g -肌动蛋白)和丝状(f -肌动蛋白)形式存在。在神经元中，脊柱形态和突触形成的调节是基于肌动蛋白细胞骨架[28]的重组。f -肌动蛋白capping蛋白亚基-亚型c，也称为CAPZB，与肌动蛋白丝的生长端结合，导致抑制肌动蛋白[29]的聚合和解聚。微管是由α/β微管蛋白二聚体组成的动态聚合物，存在于神经元树突和轴突。脑微管动力学在学习和记忆的重要过程中起着重要的作用。突触前和突触后位点的形态学和分子变化被广泛认为是学习和记忆的基础。因此，肌动蛋白和微管蛋白表达的改变可能会影响突触可塑性，从而改善糖尿病性痴呆。

氧化还原酶

L-乳酸脱氢酶（LDH）是一种催化丙酮酸和乳酸酯的互联的酶[32]。LDHA和LDHB基因产物广泛表达，两者都发现在中枢神经系统中[33]。LDHA与丙酮酸至乳酸转化率相关，LDHB具有乳酸 - 丙酮酸转化物[32]。AD患者海马的LDHB蛋白的表达水平降低[34]。乳酸在海马和皮质蛋白β的皮质中降低_25-35治疗老鼠[35]。结合我们之前的研究发现，糖尿病模型小鼠出现[6]痴呆时，海马区LDHB表达水平降低，我们预计YKS在本研究中会提高LDHB的表达水平。遗憾的是，YKS未能提高糖尿病模型小鼠海马区LDHB的表达水平。这些发现表明LDHB对YKS引起的糖尿病性痴呆没有改善作用。

蛋白质脱硫

泛素羧基末端水解酶L1 (UCH-L1)是一种去泛素化酶，在神经元细胞[36]中大量表达。UCH-L1功能障碍已被报道在神经退行性疾病的病理生理学中，包括AD[37]和帕金森病[38]。LDN-57444是可逆的UCH-L1竞争性抑制剂，在转染pz-UCH-L1[39]的瑞典突变型APP细胞系20E2细胞中，导致成熟APP显著积累。UCH-L1在散发型AD脑[40]中表达水平降低，而过表达UCH-L1可改善AD模型小鼠[41]的学习记忆缺陷。我们之前的报道显示UCH-L1在糖尿病诱导的痴呆[6]中表达水平降低。因此，在糖尿病性痴呆小鼠中，预计通过YKS治疗会增加的UCH-L1表达确实降低了，表明YKS对UCH-L1没有影响。

结论

YKS能明显改善糖尿病模型小鼠学习记忆功能障碍。yks处理的糖尿病模型小鼠海马中有10个蛋白和8个磷酸蛋白水平显著改变。YKS可能通过这些蛋白和磷酸化蛋白影响海马突触可塑性的损伤，从而改善糖尿病性痴呆。YKS改善痴呆的分子机制有待进一步研究。

作者捐款

概念化：K.M，K.K，M.T和S.M;方法：K.m，E.K，K.K，M.T，K.M和S.M;验证：K.M，K.K和K.m;正式分析：小时;调查：K.M，E.K，K.M和K.K;资源：M.T;数据策策：K.m;写作 - 原则准备：小时;写作审查和编辑：小时和下午;可视化：小时; Supervision: S.M; Project Administration: S.M; Funding Acquisition: S.M;

机构审查委员会声明

所有实验程序均按照美国国立卫生研究院动物护理和使用指南进行，并经姬路多育大学动物实验委员会确认。所有努力都是为了尽量减少动物使用和痛苦。

数据可用性声明

MS/MS数据可通过标识符为JPST001252的jPOST获得。

承认

作者感谢Nakamura（HiMeji Dokkyo大学）慷慨地提供YKS。

利益冲突

没有竞争利益申报。所有作者都已读取并同意发布的稿件版本。

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