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摘要

建立了棕榈基异丙酯中对甲苯磺酸异丙酯(IPTS)的高效液相色谱二极管阵列检测方法。样品制备包括一种易于操作的溶剂萃取技术，该技术允许在非常低的水平上对IPTS进行检测和定量。方法的检出限为0.96 μg/g，定量限为2.91 μg/g。从棕榈酸异丙酯和异丙基两种异丙酯中回收IPTS豆蔻酸盐,范围从96.1-102.1％和90.2-96.8％。变异系数小于7％，表明开发方法是准确和精确的。校准曲线（0.25至20μg/ ml）的相关系数为0.9999。该新方法用于分析不含IPT的商业异丙基酯（基于已公布的GC-FID方法的分析）。结果重新确认，在这些商业样品中未检测到0.96μg/ g的IPT。还使用气相色谱 - 质谱仪检测器（GC-MSD）来确认在异丙基酯的尖刺样品中的IPTS的身份。

关键字

石油化学、基因毒性活性、异丙酯、对甲苯磺酸异丙酯、高效液相色谱、方法验证

介绍

异丙基酯广泛用于化妆品和局部药用制剂，特别是当需要通过皮肤递送活性成分[1]。许多异丙酯生产中使用的传统方法是脂肪酸与异丙醇的酯化。p-甲苯磺酸是该工艺中常用的均相催化剂。在酯化过程中，可能发生一种称为烷基化的副反应。该工艺条件(无碱、无水和高温)可能引起烷基化。Tosylation涉及的反应是p-甲苯磺酸和异丙醇生成副产物异丙基p-toluenesulfonate(进行)。

IPTS的基因毒性活性，或异丙基甲苯磺酸，以及其他类型的烷基甲苯磺酸盐，甲磺酸盐和苯磺酸盐，已在一在体外研究[3]。迄今为止，只有欧洲药品管理局(EMA)和美国食品药品管理局(FDA)提出的协议草案中才有基因毒性杂质的限制，主要涉及原料药和产品[4,5]。到目前为止，对异丙酯中IPTS尚无监管限制。色谱方法定量分析各种类型的磺酸酯，包括IPTS，已经有报道，但仅限于原料药和产品[6-14]。本文介绍了用气相色谱-火焰离子化检测器(FID)测定棕榈油衍生异丙酯中IPTS的方法。该方法的检出限为12.5µg/g，定量限为25µg/g[15]。在这项工作中，我们报告了一个改进的方法使用高效液相色谱二极管阵列探测器(DAD)。该方法可以在很低的水平上准确、精密度地检测和定量棕榈油衍生异丙酯中的IPTS。

实验

化学品、材料及仪器

马来西亚Pulau Pinang的AcidChem International Sdn Bhd提供了用于回收研究的棕榈酸异丙酯和肉豆酸异丙酯的样品。采用所开发的IPTS监测方法从商业公司获得了异丙酯。阿波罗科学公司(英国柴郡)提供异丙基p-甲苯磺酸盐（纯度97%）。HPLC级乙腈（>99.0%纯度）和纯化水均由Fischer Scientific（美国宾夕法尼亚州匹兹堡）提供。杜兰酒店^®容量瓶（10 mL）来自肖特有限公司（西德美因茨），而电子分配器Multipette stream（组合为0.2和2.5 mL）则从Eppendorf（德国汉堡）购买。microvials（零件号：5182-0715）由安捷伦科技公司（美国加利福尼亚州帕洛阿尔托）提供，涡旋混合器由Benchmark Scientific Inc（美国新泽西州）提供。Hypersil金反相C8柱（内径250mm×4.6mm，粒径5μm）由美国马萨诸塞州沃尔坦市热电科学有限公司提供。

校准标准的解决方案

IPT的初始标准储备溶液(≈ 1000μg/mL）在HPLC级乙腈中制备。然后使用乙腈将其稀释至100µg/mL作为二级储备溶液。通过用乙腈稀释二次储备溶液制备六种浓度范围为0.25至20μg/mL的校准标准。

样品制备，加钉/回收研究

在每种情况下，将异丙基酯（2g）转移到10ml容量瓶中，并使用初始标准储备溶液（1000μg/ ml）用IPTS掺入。然后，制备含有三种尖峰IPT的异丙基酯，即2.5,5.0和50.0μg/ g。使用此处描述的溶剂提取技术从尖刺样品中回收IPT。将乙腈填充到标记（10mL）中，使用涡旋振荡器将混合物均化几分钟，以便于将IPT萃取到乙腈馏分中。在将混合物沉降到两层之后，将上层（乙腈）小心地转移到另外10ml容量瓶中，直至酯层上方约1ml残留的乙腈。加入第二部分乙腈（2mL），然后分别为第二和第三萃取的第三部分（1mL）。然后将收集的乙腈提取物与第一提取物组合。在用HPLC-DAD分析之前，在体积烧瓶中，在体积瓶中的体积为10ml的组合萃取物。

工业异丙酯中IPTS监测的样品制备

将商品异丙酯(2g)准确地转移到10ml容量瓶中。样品以1µg/g和5µg/g加标。从异丙酯中提取IPTS的工艺与添加/回收研究中描述的相同。在HPLC-DAD分析前，用乙腈将含有组合提取物的10ml容量瓶填充至标记。

高效液相色谱法及分析条件

分析采用安捷伦高效液相色谱法(Palo Alto, CA, USA)进行。该系统配备了一个二极管阵列探测器，一个第四系泵和一个恒温柱室。使用Agilent Open Lab Chem Station软件进行数据采集和仪器控制。采用自动进样器将标准品、加标品和空白酯样品(5µL)注入HPLC体系。采用反相C8色谱柱进行等压分离。流动相为乙腈:水(50:50 v/v)的混合物。流速1.0 mL/min，柱温24^oC. IPTS定量采用外标。

气相色谱-质谱联用鉴定

采用气相色谱-质谱检测器(15)法检测加标异丙酯样品中的IPTS。首先采用新建立的高效液相色谱法对加标样品进行分析，并与IPTS标准品的保留时间进行比较，确定IPTS峰。然后对同一样品进行GC-MSD分析。采用安捷伦技术公司7890A-5975C的气相色谱-质谱联用仪，配以安捷伦19091J-413 MSHP-5色谱柱(30米长，0.25 mm ID, 0.25 μm膜厚)进行分析。烤箱温度设定在100的起始温度^ºC并保持1分钟，然后在4ºC/ min升至250ºC，再保持在250ºC10分钟。使用10：1的分裂模式直接注射样品（1μl）。使用扫描范围为35.0至500.0的电子撞击（EI）模式。以1.0ml / min的流速使用氦（99.99％纯度）作为载气。入口温度和压力分别为250ºC和10.52psi。

结果

采用高效液相色谱-二极管阵列检测器成功地实现了棕榈酸异丙酯和肉豆酸异丙酯中IPTS的低水平检测。图1为IPTS标准品(0.5µg/mL)、空白和添加2.5µg/g酯的异丙酯的典型HPLC图谱。通过系统适用性试验和方法验证，如线性度、检出限和定量限测定的灵敏度、精密度和选择性等进行评价。通过分析IPTS溶液(1µg/mL)得到的系统适宜性参数如下:理论板数>2000，拖尾因子<2.0，峰对称性在0.9 ~ 1.2范围内，容量因子>2。校准曲线方程为y = 127.39x + 3.1282(图S1)，相关系数为R²）0.9999。该方法的检测和定量限制分别为0.96和2.91μg/ g。进行六次重复注射乙腈的IPTS标准，最靠近LOQ（0.5μg/ mL）的浓度，以评估HPLC系统精度。发现峰面积的注射精度<2.96％，而保留时间<0.8％。通过制备六个IPTS标准溶液（2.5μg/ g）的六个独立样品来评价方法精度。将每个样品溶液注射一次。获得的％RSD水平为4.21％（IPM）和9.53％（IPP）。表1显示了从异丙基酯，IPP和IPM中的IPTS的尖峰/恢复获得的精度结果。

表格1。IPTS在异丙酯、IPP和IPM中的加钉/加加得到了准确的结果。

水平飙升 (μg g-1）	平均恢复（％）±SD（CV） n = 4
	IPP	IPM
2．5	102.1±6.2 (6.08%)	96.8±4.2 (4.35%)
5．0	96.5±4.7（4.92％）	90.2±3.9 (4.37%)
25.0	96.1±2.7 (2.84%)	96.03±2.8 (2.93%)

IPP =棕榈酸异丙酯;IPM =十四烷酸异丙酯;IPTS=对甲苯磺酸异丙酯，SD =标准差，CV =变异系数，n =重复次数

图2a为添加的异丙酯(25µg/g)的典型GC-MS总离子色谱图(TIC)。IPTS在乙腈(5 μ g/mL)中的保留时间为14.99 min (TIC未显示)。在添加的异丙酯(25µg/g)中，在14.99 min出现峰，初步鉴定为IPTS。通过Agilent GC-MSD Mass Hunter软件中可用的NIST库进一步证实了加标酯中的峰为IPTS。添加的异丙酯样品的质谱(14.99分钟)(图2b)和库(图2c)的IPM和IPP的匹配率分别为78.1%和80.1%。这进一步确认了IPTS的身份。

图2。IPP中IPTS标准品的总离子色谱(a)和质谱(b)和库中的质谱(c)。

该方法对商用异丙酯的适用性

该研究的目的是在比报告的GC-FID方法的检测限度下检测IPT，其为12.5μg/ g（15）。首先使用GC-FID方法分析来自不同来源的八种类型的商业异丙酯，未检测到IPTS。使用新开发的方法再次分析了这些相同的样品。结果表明，在0.96μg/ g的低下床上也没有检测到IPT。为了进一步证实新方法的适用性，将相同的八种商业样品以1μg/ g（接近检测极限），5μg/ g和25μg/ g。发现该方法能够在商业样品中检测1μg/ g的IPTS峰峰值。所有八个掺入样品的百分比恢复为5μg/ g和25μg/ g在可接受的限度范围内为80-120％。

讨论

样品制备，色谱方法开发及系统适用性

在以前用气相色谱-火焰离子化检测器分析异丙酯中IPTS的工作中，在气相色谱分析之前使用了一种简单的溶解和注入的样品制备技术。进样时，进样口分流比为10:1[15]。然而，这种样品制备技术有一定的局限性。基质的存在限制了能够引入GC入口的加钉IPTS的数量。如果需要较低的检测限，则可能需要将较高的样本量引入气相色谱系统。这是通过改变分流比或使用无分流入口模式来实现的。然而，酯基质的存在可能会导致气相色谱柱超载。这反过来又可能导致矩阵干扰IPTS峰。

在这项工作中，发现可以使用HPLC-DAD方法分析异丙酯中的IPT，以检测化妆品基质中的IPT。然而，对样品制备和流动相组成进行了修改。流动相混合物的水相为HPLC级水，不添加缓冲液磷酸四丁基铵，如化妆品基质所用方法[16]。HPLC流动相混合物能够在不添加缓冲液的情况下选择性检测异丙酯中的IPT。异丙酯采用不同的样品制备技术。对于化妆品，第一步是将样品溶解在乙腈中，然后使用漩涡振动筛进行均质。然后，在注入HPLC系统之前，用特氟隆滤盘过滤每个样品。然而，用于化妆品的样品制备技术不适用于异丙酯。酯不溶于乙腈，会发生相分离，无法直接进样。使用乙腈从酯中提取IPT。IPTS在乙腈中具有良好的溶解性，但异丙酯不溶。因此，在混合过程中，酯中存在的任何IPT将收集在乙腈部分中。用于化妆品的直接注射法限制了样品制备过程中可使用的量。该方法仅能使用0.04 g/mL的重量/体积在无基质干扰的情况下分析IPT。在本研究中，使用的重量/体积为0.2 g/mL。异丙酯（0.96µg/g）中IPT的新检测限低于化妆品基质中的12.8µg/g[16]。该改良HPLC条件用于化妆品，评估其在分析不同基质（如异丙酯）时的适用性，无基质干扰。流动相混合物中也使用乙腈作为样品制备过程中的萃取溶剂。系统适用性结果进一步证实了所开发条件对棕榈油基异丙酯中IPT分析的适用性。

方法验证

用7种浓度的IPTS标准溶液评价方法的线性度。校准曲线是测量到的IPTS峰面积与浓度的平均响应曲线。相关系数(R²)为0.9999，表明线性良好(图S1)。

检测限（LOD）和定量限（LOQ）分别根据公式3.3（Sy/S）和10（Sy/S）计算。Sy是曲线响应的标准偏差，S是校准曲线的斜率。LOQ通常从具有良好精确度和精密度的最低浓度中选择。在本研究中，选择了最接近计算LOQ的峰值水平（2.5μg/g），并进行了相应的评估。结果表明，在浓度为2.5μg/g时，两种类型的异丙酯的RSD均<7%（表I），准确度和精密度均良好。

进行了尖峰和恢复测试，以评估新方法的准确性和精度。通过在四种浓度水平上掺入异丙基棕榈酸酯（IPP）和异丙基肌酐（IPM）来确定百分比恢复。在不使用的情况下制造的异丙基酯p以-甲苯磺酸为催化剂，作为加钉基质。从酯类中提取IPTS，用HPLC-DAD分析。采用外标曲线定量测定加标样品中IPTS的回收率。为确保加标样品中IPTS峰的纯度，使用OpenLab ChemStation软件进行纯度检测。在这项工作中，发现归属于IPTS的峰没有共洗脱杂质。IPTS的回收率在IPP组为961 -102.1%，IPM组为90.2-96.8%(表一)，在80 - 110%[4]的可接受范围内。以%RSD测定的回收率日内精密度<7%，表明该方法具有良好的重复性。回收率是根据添加样品的结果和已知的添加浓度计算的。空白的异丙酯样品显示没有IPTS和基体上的其他峰(图1b)。添加IPP的色谱图(图1c)显示在12.3分钟IPTS有一个峰值。 This was based on a retention time comparison with an IPTS standard solution (Figure 1a). The precision of the HPLC system (for injection and retention time) and method precision were satisfactory as indicated by RSDs of less than 10 percent. The method was also found to have good selectivity as they can be applied for low level detection of IPTS in commercial isopropyl esters from different sources.

图1所示。HPLC-DAD代表色谱图:(a) 0.5 μg ml^-1IPTS (b)空白IPP样品，(c)添加IPP 2.5 μg^-1，监测在230 nm。

结论

使用HPLC-DAD检测和定量异丙酯中的IPT，开发了一种快速、简单和改进的方法，具有极低水平检测能力。本方法的检测限比GC-FID方法低得多[15]。验证数据表明，该方法准确、精密、灵敏、线性和选择性好。样品制备简单，易于使用溶剂萃取过程处理。

承认

作者希望感谢MPOB总干事允许发表本文。这项工作完全由马来西亚棕榈油委员会资助。

参考

1. 《化妆品添加剂:工业指南》。诺伊斯出版社，帕克里奇，新泽西州。
2. 脂肪酸与脂肪的反应。见:贝利的工业油和脂肪产品(Swern, D, ed.)， Wiley，纽约，pp: 99-176。
3. Glowienke S, Frieauff W, Allmendinger T, Martus HJ, Suter W, et al.(2005)评估19种甲烷、苯和甲苯磺酸酯的结构-活性考虑和体外方法的遗传毒性。Mutat Res581: 23 - 24日。［Crossref］
4. FDA(2008)原料药和产品中的遗传毒性和致癌杂质行业指南:美国食品和药物管理局推荐方法。http://www.fda.gov/cder/guidance/index.htm。
5. EMA(2006)基因毒性杂质限值指南。欧洲药品管理局人用药品委员会。http://www.emea.europa.eu
6. 郭涛，石勇，郑磊，郑飞，冯飞，等。(2014)液相色谱-串联质谱法快速同时测定原料药中磺化酯类基因毒性杂质:不同电离模式的比较。J Chromatogr1355: 73 - 70。［Crossref］
7. Devenport NA, Sealey LC, Alruways FH, Weston DJ, Reynolds JC, et al.(2013)利用常压热解吸-萃取电喷雾质谱法直接检测一种磺化酯基因毒性杂质。肛门化学85: 6224 - 6227。［Crossref］
8. Wollein U, Schramek N(2012)直接注射气相色谱-质谱联用法同时测定药物成品中甲磺酸烷基酯和甲磺酸烷基酯。Eur J Pharm Sci45: 201 - 04。［Crossref］
9. Kakadiya PR, Reddy BP, Singh V, Ganguly S, Chandrashekhar TG, et al.(2011)电喷雾电离LC/MS/MS低水平测定洛皮那韦和利托那韦活性药物成分中的甲基磺酸甲酯和甲基磺酸乙酯杂质。J Pharm Biomed Anal55：379-84。［Crossref］
10. 气相色谱-质谱联用技术测定甲磺酸多沙唑嗪中烷基甲基磺酸盐。印度医药科学杂志73: 107 - 110。［Crossref］
11. Ramakrishna K, Raman NV, Rao KM, Prasad AV, Reddy KS(2008)气相色谱-质谱法测定甲磺酸伊马替尼中甲磺酸甲酯和甲磺酸乙酯的含量。J Pharm Biomed Anal46:780 - 83。［Crossref］
12. Taylor GE, Gosling M, Pearce A(2006)高效液相色谱-质谱法痕量测定原料药中对甲苯磺酸盐和苯磺酸盐酯。J Chromatogr1119: 231 - 237。［Crossref］
13. 固相微萃取-气相色谱/SIM/MS联用法测定有效药物成分中甲烷磺酸、苯磺酸和对甲苯磺酸的甲酯和乙酯。J Pharm Biomed Anal39: 477 - 485。［Crossref］
14. 李伟(2004)药品中甲基磺酸甲酯、甲基磺酸乙酯和甲基磺酸异丙酯残留的毛细管气相色谱-火焰离子化检测。J Chromatogr1046: 297 - 301。［Crossref］
15. Tay BYP(2013)气相色谱-火焰离子化检测分析棕榈酯中对甲苯磺酸异丙酯，并用质谱证实。国际宇航科学杂志35: 57 - 63。［Crossref］
16. Tay BYP，Yung SC，Teoh TY（2016）通过HPLC二极管阵列检测器法和GC-MS测定和确认化妆品中的对甲苯磺酸异丙酯。国际宇航科学杂志38: 627 - 33所示。［Crossref］